Хотстарт Так ДНК полимераза
Хот Старт Так ДНК полимераза (модификација антитела) је термостабилна ДНК полимераза са врућим стартом из Тхермус акуатицус ИТ-1, која поседује активност полимеразе 5′→3′ и активност ендонуклеазе 5´ режња.Так ДНК полимераза са врућим стартом је Так ДНК полимераза која је модификована термолабилним Так антителима.Модификација антитела повећала је специфичност, осетљивост и принос ПЦР-а.
Компоненте
| Саставни део | HC1012А-01 | HC1012А-02 | HC1012А-03 | HC1012А-04 |
| 5×ХЦ Так пуфер | 4×1 мЛ | 4×10 мЛ | 4×50 мЛ | 5×400 мЛ |
| Хот Старт Так ДНК полимераза (модификована антитела) (5 У/μЛ) | 0,1 мЛ | 1 мЛ | 5 мЛ | 10×5 мЛ |
Апликације
10 мМ Трис-ХЦл (пХ 7,4 на 25 ℃), 100 мМ КЦл, 0,1 мМ ЕДТА, 1 мМ дитиотреитол, 0,5% Твеен20, 0,5% ИГЕПАЛЦА-630 и 50% глицерол.
Кондиција складишта
Транспортовати на 0°Ц и чувати на -25°Ц~-15°Ц.
Дефиниција јединице
Једна јединица је дефинисана као количина ензима која инкорпорира 15 нмол дНТП у материјал нерастворљив у киселини за 30 минута на 75°Ц.
Контрола квалитета
1.Endактивност онуклеазе:Инкубација 20 У ензима са 4 μг пУЦ19 ДНК током 4 сата на 37 ℃ није довела до детектабилне деградације ДНК као што је утврђено гел електрофорезом.
2.5 кб Ламбда ПЦР:25 циклуса ПЦР амплификације 5 нг Ламбда ДНК са 1,25 јединица Так ДНК полимеразе у присуству 200 µМ дНТП-а и 0,2 µМ прајмера даје очекивани производ од 5 кб.
3.Еконуцлеасе Ацтивити:Инкубација реакције од 50 µл која садржи најмање 12,5 У Так ДНК полимеразе са 10 нмол 5´-ФАМ олигонуклеотида током 30 минута на 37 ℃ не даје деградацију која се може детектовати.
4.Активност РНасе:Инкубација 10 µЛ реакције која садржи 20 У ензима са 1 μг РНК транскрипата током 2 сата на 37°Ц није довела до детектабилне деградације РНК као што је утврђено гел електрофорезом.
5.Инактивација топлоте:Не.
Реакциони систем
| Компоненте | Волуме |
| Шаблон ДНКa | опционо |
| 10 μМ Форвард Пример | 0,5 μЛ |
| 10 μМ Реверсе Пример | 0,5 μЛ |
| дНТП мешавина (10мМ сваки) | 0,5 μЛ |
| 5×ХЦ Так пуфер | 5 μЛ |
| Так ДНК полимеразаб(5У/μЛ) | 0,125 μЛ |
| Вода без нуклеаза | До 25 μЛ |
напомене:
1) а.
| ДНК | Износ |
| Геномски | 1 нг-1 μг |
| Плазмид или вирус | 1 пг-1 нг |
2) б.Оптимална концентрација Так ДНК полимеразе може да се креће од 5-50 јединица/мЛ (0,1-0,5 јединица/25 µЛ реакција) у специјализованим применама.
Протокол термичког циклуса
ПЦР
| Корак | Температура(°Ц) | време | Циклуси |
| Почетна денатурацијаa | 95 ℃ | 1-3 мин | - |
| Денатурација | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 циклуса |
| Жарењеб | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Продужетак | 68 ℃ | 1 кб/мин | |
| Финал Ектенсион | 68 ℃ | 5минс | - |
напомене:
1) Почетна денатурација од 1 мин на 95°Ц довољна је за већину амплификација.За тешке шаблоне, препоручује се дужа денатурација од 2-3 минута на 95°Ц.Код ПЦР колоније препоручује се почетна денатурација од 5 минута на 95°Ц.
2) Корак жарења је типично 15-60 с.Температура жарења се заснива на Тм пара прајмера и обично је 45-68 ℃.
