Рнасе Инхибитор
Инхибитор мишје РНазе је рекомбинантни инхибитор мишје РНазе експримиран и пречишћен из Е.цоли.Везује се за РНКазу А, Б или Ц у односу 1:1 кроз нековалентно везивање, чиме инхибира активност три ензима и штити РНК од деградације.Међутим, није ефикасан против РНазе 1, РНазе Т1, С1 нуклеазе, РНазе Х или РНазе из Аспергиллус-а.Инхибитор мишје РНазе је тестиран помоћу РТ-ПЦР, РТ-кПЦР и ИВТ мРНА и био је компатибилан са различитим комерцијалним реверзним транскриптазама, ДНК полимеразама и РНК полимеразама.
У поређењу са хуманим инхибиторима РНКазе, мишји инхибитор РНКазе не садржи два цистеина који су високо осетљиви на оксидацију која изазива инактивацију инхибитора.То га чини стабилним при ниским концентрацијама ДТТ (мање од 1 мМ).Ова карактеристика га чини погодним за употребу у реакцијама где су високе концентрације ДТТ штетне за реакцију (нпр. РТ-ПЦР у реалном времену).
Aапликација
Овај производ се може широко користити у било ком експерименту где је могућа интерференција РНасе да би се избегла деградација РНК, као што су:
1.Синтеза првог ланца цДНК, РТ-ПЦР, РТ-кПЦР, итд.
2.Штити РНК од деградације током ин витро транскрипције/транслације (нпр. ин витро систем репликације вируса).
3.Инхибиција активности РНКазе током одвајања и пречишћавања РНК.
Услови складиштења
Производ се може чувати на -25～- 15 ℃, важи 2 године.
Бафер за складиштење
50 мМ КЦл, 20 мМ ХЕПЕС-КОХ (пХ 7,6, 25 ℃), 8 мМ ДТТ и 50% глицерола.
Дефиниција јединице
Количина инхибитора мишје РНазе која је потребна да инхибира активност 5 нг рибонуклеазе А за 50% дефинисана је као једна јединица (У).
Молекуларна тежина протеина
Молекуларна тежина мишјег инхибитора РНКазе је 50 кДа.
Контрола квалитета
Егзонуклеаза Активност:
40 У мишјег инхибитора РНКазе са 1 μг λ-Хинд ИИИ дигестира ДНК на 37℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом агарозног гела.
Активност ендонуклеазе:
40 У мишјег инхибитора РНКазе са 1 μг λ ДНК на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.
Ницкинг Активност:
40У инхибитора мишје РНазе са 1 μг пБР322 на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.
РНасе Активност:
40У инхибитора мишје РНазе са 1,6 μг МС2 РНК током 4 сата на 37 ℃ не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.
E.цоли ДНК:
40 У мишјег инхибитора РНКазе се тестира на присуство геномске ДНК Е. цоли коришћењем ТакМан кПЦР са прајмерима специфичним за локус Е. цоли 16С рРНА.Контаминација геномске ДНК Е. цоли је ≤ 0,1 пг/40 У.
Nотеs
1. Насилне осцилације или мешање ће довести до инактивације ензима.
2. Оптимални температурни опсег овог инхибитора био је 25-55 ℃, а деактивиран је на 65 ℃ и више.
3. Активности РНазе Х, РНазе 1 и РНазе Т1 нису инхибиране мишјим инхибитором РНазе.
4. Инхибиција активности РНазе је пронађена у широком опсегу пХ (пХ 5-9 су сви били активни), а највећа активност је примећена при пХ 7-8.
5. Пошто рибонуклеазе типично задржавају активност у условима денатурације, мора се водити рачуна да се избегне денатурација молекула инхибитора РНазе који су комплексирали са рибонуклеазом.Да би се спречило ослобађање активне рибонуклеазе, треба избегавати температуре веће од 50 °Ц и високе концентрације урее или других денатурирајућих агенаса.
