Протеиназа К (лиофилизовани прах)
Каталошки број: ХЦ4500А
Протеиназа К је стабилна серинска протеаза са широком специфичношћу супстрата.Разграђује многе протеине у природном стању чак и у присуству детерџената.Докази из студија кристалне и молекуларне структуре указују на то да ензим припада породици субтилизина са каталитичком тријадом активног места (Асп39-Његов69- Сер224).Преовлађујуће место цепања је пептидна веза поред карбоксилне групе алифатичних и ароматичних амино киселина са блокираним алфа амино групама.Обично се користи због своје широкеспецифичност.
Услови складиштења
2-8℃ краткорочно складиштење, -25~-15℃ дуготрајно складиштење.Статус сувог праха -25~-15℃ важи 3 године;ензимски прах треба растворити у одговарајућој запремини.
Спецификација
| Изглед | Бели до скоро бели аморфни лиофилизовани прах |
| Активност | ≥30 У/мг |
| ДНасе | Није откривено |
| РНасе | Није откривено |
Својства
| ЕЦ број | 3.4.21.64 (Рекомбинант из албума Тритирацхиум) |
| Молекуларна тежина | 29 кДа (СДС-ПАГЕ) |
| Изоелектрична тачка | 7.81 |
| Оптимални пХ | 7.0-12.0 Сл.1 |
| Оптимална температура | 65 ℃ Сл.2 |
| пХ стабилност | пХ 4,5-12,5 (25℃, 16х) Сл.3 |
| Термичка стабилност | Испод 50℃ (пХ 8,0, 30 мин) Сл.4 |
| Активатори | СДС, уреа |
| Инхибитори | Диизопропил флуорофосфат;фенилметилсулфонил флуорид |
Апликације
1. Генетски дијагностички комплет
2. Комплети за екстракцију РНК и ДНК
3. Екстракција непротеинских компоненти из ткива, деградација протеинских нечистоћа, као што су ДНК вакцине и припрема хепарина
4. Припрема ДНК хромозома пулсном електрофорезом
5. Вестерн блот
6. Ензимски гликозиловани албумински реагенси ин витро дијагностика
Превентивне мере
Носите заштитне рукавице и заштитне наочаре када користите или вагате, и добро проветрите након употребе.Овај производ може изазвати алергијску реакцију коже и озбиљну иритацију очију.Ако се удише, може изазвати алергију или симптоме астме или диспнеју.Може изазвати иритацију дисајних путева.
Анализа
Дефиниција јединице
Једна јединица (У) је дефинисана као количина ензима потребна за хидролизу казеина за производњу 1 μмол тирозина у минути под следећим условима.
Припрема реагенса
Реагенс И: 1 г млечног казеина растворен је у 50 мл 0,1 М раствора натријум фосфата (пХ 8,0), инкубиран у води на 65-70 ℃ 15 минута, мешан и растворен, охлађен водом, подешен натријум хидроксидом на пХ 8,0 и фиксирана запремина пХ вредности 8,0, 1 г млечног казеина. 100мл.
Реагенс ИИ: 0,1 М трихлорсирћетна киселина, 0,2 М натријум ацетат, 0,3 М сирћетна киселина.
Реагенс ИИИ: 0,4 М На2CO3решење.
Реагенс ИВ: Форинт реагенс разблажен чистом водом 5 пута.
Реагенс В: ензимски разблаживач: 0,1 М раствор натријум фосфата (пХ 8,0).
Реагенс ВИ: раствор тирозина: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин растворен са 0,2 М ХЦЛ.
Процедура
1. 0,5 мл реагенса И је претходно загрејано на 37℃, додати 0,5мл раствора ензима, добро измешати и инкубирати на 37℃ 10 минута.
2. Додајте 1 мл реагенса ИИ да зауставите реакцију, добро промешајте и наставите инкубацију 30 минута.
3. Центрифугирајте реакциони раствор.
4. Узмите 0,5 мл супернатанта, додајте 2,5 мл реагенса ИИИ, 0,5 мл реагенса ИВ, добро промешајте и инкубирајте на 37 ℃ 30 минута.
5. ОД660одређена је као ОД1;празна контролна група: 0,5 мл реагенса В се користи за замену раствора ензима за одређивање ОД660као ОД2, ΔОД=ОД1-ОД2.
6. Стандардна крива Л-тирозина: 0,5 мЛ различите концентрације Л раствора тирозина, 2,5 мЛ реагенса ИИИ, 0,5 мЛ реагенса ИВ у епрувети за центрифугирање од 5 мЛ, инкубирајте на 37 ℃ 30 минута, откријте ОД660за различите концентрације Л-тирозина, тада се добија стандардна крива И=кКс+б, где је И концентрација Л-тирозина, Кс је ОД600.
Калкулација
2: Укупна запремина реакционог раствора (мЛ)
0,5: Запремина раствора ензима (мЛ)
0,5: Запремина реакционе течности која се користи за хромогено одређивање (мЛ)
10: Време реакције (мин)
Df: Вишеструко разблаживање
C: Концентрација ензима (мг/мЛ)
Референце
1. Виегер У & Хилз Х. ФЕБС Летт.(1972);23:77.
2. Виегер У & Хилз Х. Биоцхем.Биопхис.Рес.Цоммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.ет ал.,ЕУР.Ј. Биоцхем.(1975);56:103–108.
4. Самброок Јet ал., Молекуларно клонирање: Лабораторијски приручник, 2. издање, Цолд Спринг ХарборЛаборатори Пресс, Цолд Спринг Харбор (1989).
Слика 2 Оптимална температура
Реакција у 20 мМ К-фосфатном пуферу пХ 8,0.Концентрација ензима: 1мг/мЛ
Слика 3 пХ Стабилност
25 ℃, 16 х-третман са 50 мМ пуферског раствора: пХ 4,5-5,5, ацетат;пХ 6,0-8,0, На-фосфат;пХ 8,0-9,0, Трис-ХЦЛ.пХ 9,0-12,5, глицин-НаОХ.Концентрација ензима: 1мг/мЛ
Слика 4 Термички стабилност
Третман од 30 минута са 50 мМ Трис-ХЦЛ пуфера, пХ 8,0.Концентрација ензима: 1мг/мЛ
Слика 5 Складиштење стабилиty at 25℃
