Вилд Так ДНК полимераза
Так ДНК полимераза је термостабилна ДНК полимераза из Тхермус акуатицус ИТ-1, која поседује активност 5′→3′ полимеразе и активност ендонуклеазе 5´ клапна.
Компоненте
| Саставни део | HC1010А-01 | HC1010А-02 | HC1010А-03 | HC1010А-04 |
| 10× Так бафер | 2×1 мЛ | 2×10 мЛ | 2×50 мЛ | 5×200 мЛ |
| Так ДНК полимераза (5 У/μЛ) | 0,1 мЛ | 1 мЛ | 5 мЛ | 5×10 мЛ |
Кондиција складишта
Транспортовати на 0°Ц и чувати на -25°Ц~-15°Ц.
Дефиниција јединице
Једна јединица је дефинисана као количина ензима која инкорпорира 15 нмол дНТП у материјал нерастворљив у киселини за 30 минута на 75°Ц.
Контрола квалитета
1.Тест чистоће протеина (СДС-ПАГЕ):Чистоћа Так ДНК полимеразе била је ≥95% одређена СДС-ПАГЕ анализом.
2.Endактивност онуклеазе:Најмање 5 У Так ДНК полимеразе са 1 μг λДНК током 16 сати на 37 ℃ не доводи до детектљиве деградације као што је утврђено.
3.Еконуцлеасе Ацтивити:Најмање 5 У Так ДНК полимеразе са 1 μг λ -Хинд Ⅲ варе ДНК током 16 сати на 37 ℃ не доводи до детектљиве деградације као што је утврђено.
4.Ницкасе Ацтивити:Најмање 5 У Так ДНК полимеразе са 1 μг пБР322 ДНК током 16 сати на 37°Ц не доводи до детектабилне деградације као што је утврђено.
5.Активност РНасе:Најмање 5 У Так ДНК полимеразе са 1,6 μг МС2 РНК током 16 сати на 37°Ц не доводи до детектљиве деградације као што је утврђено.
6.Е. цолиДНК:5 У Так ДНК полимеразе је тестирано на присуство геномске ДНК Е. цоли коришћењем ТакМан кПЦР са прајмерима специфичним за локус Е. цоли 16С рРНА.Контаминација геномске ДНК Е. цоли је ≤1 копија.
7.ПЦР амплификација (5,0 кб Ламбда ДНК)- Реакција од 50 µЛ која садржи 5 нг Ламбда ДНК са 5 јединица Так ДНК полимеразе за 25 циклуса ПЦР амплификације резултира у очекиваном производу од 5,0 кб.
Реацтион Сетуп
| Компоненте | Волуме |
| Шаблон ДНКa | опционо |
| 10 μМ Форвард Пример | 1 μЛ |
| 10 μМ Реверсе Пример | 1 μЛ |
| дНТП мешавина (10мМ сваки) | 1 μЛ |
| 10×Так бафер | 5 μЛ |
| Так ДНК полимеразаб | 0,25 μЛ |
| Вода без нуклеаза | До 50 μЛ |
напомене:
1) Оптимална реакциона концентрација различитих шаблона је различита.Следећа табела приказује препоручену употребу шаблона за реакциони систем од 50 µЛ.
| ДНК | Износ |
| Геномски | 1 нг-1 μг |
| Плазмид или вирус | 1 пг-1 нг |
2) Оптимална концентрација Так ДНК полимеразе може да се креће од 0,25 µЛ~1 µЛ у специјализованим применама.
РеакцијаПрограм
| Корак | Температура(°Ц) | време | Циклуси |
| Почетна денатурацијаa | 95 ℃ | 5минс | - |
| Денатурација | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 циклуса |
| Жарењеб | 60 ℃ | 15 с | |
| Продужетак | 72 ℃ | 1 кб/мин | |
| Финал Ектенсион | 72 ℃ | 5минс | - |
напомене:
1) Почетни услов денатурације је погодан за већину реакција амплификације и може се модификовати у складу са сложеношћу структуре шаблона.Ако је структура шаблона сложена, време пре-денатурације се може продужити на 5 – 10 минута да би се побољшао почетни ефекат денатурације.
2) Температуру жарења треба подесити према Тм вредности прајмера, која је генерално подешена на 3~5 ℃ ниже од вредности Тм прајмера;За сложене шаблоне, потребно је подесити температуру жарења и продужити време продужења да би се постигло ефикасно појачање.
