Протеиназа К мНГС (течност)
Протеиназа К је стабилна серинска протеаза са широком специфичношћу супстрата.Разграђује многе протеине у природном стању чак и у присуству детерџената.Докази из студија кристалне и молекуларне структуре указују на то да ензим припада породици субтилизина са каталитичком тријадом активног места (Асп39-Његов69-Сер224).Преовлађујуће место цепања је пептидна веза поред карбоксилне групе алифатичних и ароматичних амино киселина са блокираним алфа амино групама.Обично се користи због своје широке специфичности.Ова протеиназа К је специјално дизајнирана за мНГС.У поређењу са другом протеиназом К, садржи још мање контаминације нуклеинском киселином са истим ензимским перформансама, што би могло боље да обезбеди низводну примену мНГС.
Услови складиштења
2-8 ℃ током 2 године
Спецификација
| Изглед | Безбојна до светло смеђа течност |
| Активност | ≥800 У/мл |
| Концентрација протеина | ≥20 мг/мл |
| Ницкасе | Није откривено |
| ДНасе | Није откривено |
| РНасе | Није откривено |
Својства
| ЕЦ број | 3.4.21.64(Рекомбинант из албума Тритирацхиум) |
| Изоелектрична тачка | 7.81 |
| Оптимални пХ | 7.0- 12.0 Слика 1 |
| Оптимална температура | 65 ℃ Сл. 2 |
| пХ стабилност | пХ 4,5-12,5 (25 ℃, 16 х) Слика 3 |
| Термичка стабилност | Испод 50 ℃ (пХ 8,0, 30 мин) Слика 4 |
| Стабилност складиштења | Преко 90% активности током 12 месеци на 25 ℃ |
| Активатори | СДС, уреа |
| Инхибитори | Диизопропил флуорофосфат;фенилметилсулфонил флуорид |
Апликације
1. Генетски дијагностички комплет
2. Комплети за екстракцију РНК и ДНК
3. Екстракција непротеинских компоненти из ткива, деградација протеинских нечистоћа, као што је ДНКвакцине и припрема хепарина
4. Припрема ДНК хромозома пулсном електрофорезом
5. Вестерн блот
6. Ензимски гликозиловани албумински реагенси ин витро дијагностика
Превентивне мере
Носите заштитне рукавице и заштитне наочаре када користите или вагате, и добро проветрите након употребе.Овај производ може изазвати алергијску реакцију коже и озбиљну иритацију очију.Ако се удише, може изазвати алергију или симптоме астме или диспнеју.Може изазвати иритацију дисајних путева.
Дефиниција јединице
Једна јединица (У) је дефинисана као количина ензима потребна за хидролизу казеина за производњу 1 μмолтирозина у минути под следећим условима.
Припрема реагенса
Реагенс И: 1 г млечног казеина растворен је у 50 мл 0,1 М раствора натријум фосфата (пХ 8,0), инкубиран у води на 65-70 ℃ 15 минута, мешан и растворен, охлађен водом, подешен натријум хидроксидом на пХ 8,0 и фиксирана запремина пХ вредности 8,0, 1 г млечног казеина. 100мл.
Реагенс ИИ: 0,1 М трихлорсирћетна киселина, 0,2 М натријум ацетат, 0,3 М сирћетна киселина.
Реагенс ИИИ: 0,4 М На2CO3решење.
Реагенс ИВ: Форинт реагенс разблажен чистом водом 5 пута.
Реагенс В: Ензимски разблаживач: 0,1 М раствор натријум фосфата (пХ 8,0).
Реагенс ВИ: раствор тирозина: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин растворен са 0,2М ХЦл.
Процедура
1. 0,5 мл реагенса И је претходно загрејано на 37℃, додати 0,5 мл раствора ензима, добро промешати и инкубирати на37 ℃ током 10 минута.
2. Додајте 1 мл реагенса ИИ да зауставите реакцију, добро промешајте и наставите инкубацију 30 минута.
3. Центрифугирајте реакциони раствор.
4. Узмите 0,5 мл супернатанта, додајте 2,5 мл реагенса ИИИ, 0,5 мл реагенса ИВ, добро промешајте и инкубирајте на 37℃за 30 мин.
5. ОД660одређена је као ОД1;празна контролна група: 0,5 мл реагенса В се користи за замену ензимарешење за одређивање ОД660као ОД2, ΔОД=ОД1-ОД2.
6. Стандардна крива Л-тирозина: 0,5 мЛ раствора Л-тирозина различите концентрације, 2,5 мЛ реагенса ИИИ, 0,5 мЛ реагенса ИВ у епрувети за центрифугирање од 5 мЛ, инкубирајте на 37 ℃ 30 минута, откријте ОД660за различите концентрације Л-тирозина, тада се добија стандардна крива И=кКс+б, где је И концентрација Л-тирозина, Кс је ОД600.
Калкулација
2: Укупна запремина реакционог раствора (мЛ)
0,5: Запремина раствора ензима (мЛ)
0,5: Запремина реакционе течности која се користи за хромогено одређивање (мЛ)
10: Време реакције (мин)
Df: Вишеструко разблаживање
C: Концентрација ензима (мг/мЛ)
Референце
1. Виегер У & Хилз Х. ФЕБС Летт.(1972);23:77.
2. Виегер У & Хилз Х. Биоцхем.Биопхис.Рес.Цоммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.ет ал.,ЕУР.Ј. Биоцхем.(1975);56:103–108.
4. Самброок Јet ал., Молекуларно клонирање: Лабораторијски приручник, 2. издање, Цолд Спринг ХарборЛабораторијска штампа, Цолд Спринг Харбор (1989).
Фигурес
Шипак.1 Оптимум pH
100 мМ пуферски раствор: пХ 6,0-8,0, На-фосфат;пХ 8,0-9,0, Трис-ХЦл;пХ9,0-12,5, глицин-НаОХ. Концентрација ензима: 1мг/мЛ
Слика 2 Оптимална температура
Реакција у 20 мМ К-фосфатном пуферу пХ 8,0.Концентрација ензима: 1 мг/мЛ
Слика 3 пХ Стабилност
25 ℃, 16 х-третман са 50 мМ пуферским раствором: пХ 4,5-5,5, ацетат;пХ 6,0-8,0, На-фосфат;пХ 8,0-9,0, Трис-ХЦл.пХ 9,0-12,5, глицин-НаОХ.Концентрација ензима: 1 мг/мЛ
Сл.4 Термички стабилност
Третман од 30 минута са 50 мМ Трис-ХЦл пуфера, пХ 8,0.Концентрација ензима: 1 мг/мЛ
Сл.5 Складиштење стабилиty at 25℃
