Комплет за директни ПЦР биљака

Каталошки број: ХЦР2020А

Плант Дирецт ПЦР комплет је погодан за директно амплификацију листова биљака, семена итд., и може се користити за скрининг високог протока биљних узорака који не садрже полисахариде и полифеноле.Директна амплификација ДНК полимеразе заснована на усмереној еволуцији има супериорну толеранцију на ПЦР инхибиторе у биљкама.У међувремену, одржава високе перформансе амплификације, што је погодно за амплификацију фрагмената ДНК унутар 5 кб.Јединствени пуфер за лизу А у комплету може се користити за лизу свежих или смрзнутих биљних ткива.Лако је за руковање и лизат се може користити као шаблон за амплификацију без пречишћавања.Систем садржи заштитне агенсе који омогућавају да се сирови узорци ефикасно појачају након поновног замрзавања и одмрзавања.2 × Плант Дирецт Мастер Мик треба само да дода прајмере и шаблоне да би извршио реакцију амплификације, чиме се смањују операције пипетирања и побољшавају проток детекције и поновљивост резултата.

Компоненте

*Плант Дирецт Лисис Буффер Б је опциони реагенс, који се користи за неутрализацију Плант Дирецт Лисис Буффер А ради продужавања времена складиштења узорака.Може се користити у складу са стварном ситуацијом.

Услови складиштења

2 × Плант Дирецт Мастер Мик, чувајте на -30 ~ -15℃ и избегавајте поновно замрзавање и одмрзавање;Пуфер за директну лизу биљака, чувајте на -30 ~ -15 ℃ или 2 ~ 8 ℃.

Експеримент процес

Обрада узорка–Плант Леаф

Директан метод:Препоручује се употреба младих листова.Користите бушилицу за рупе фиксног пречника од 0,5 – 3 мм да бисте добили мали и уједначен узорак, а затим директно додајте узорак у ПЦР систем (препоручује се систем од 50 μл).Напомена, уверите се да је узорак у ПЦР раствору, а не на зиду епрувете.Ако се директни ПЦР користи за амплификацију дугих фрагмената и сложених узорака, коришћење узорка мањег пречника (0,5 – 1 мм) као шаблона може помоћи да се добију бољи резултати.

Метода лизе млевења:Препоручује се употреба младих листова.Узмите мали комад листа (око 1 – 3 мм у пречнику), ставите га у 20 μл Плант Дирецт Лисис Буффер Аб и самељите што је више могуће (овај корак се може урадити стискањем листа врхом пипете од 100 μл за гњечење узорка).Ако се користе веће количине ткива листа (не прелазе 7 мм), повећајте запремину пуфера за разблаживање на 50 μл.Након што се листови мељу, раствор треба да изгледа зелено.После кратког центрифугирања, додајте 1 μл супернатанта у ПЦР систем као реакциони шаблон.

Метода термичке лизе:Препоручује се употреба младих листова.Узмите мали комад листа (око 1 – 3 мм у пречнику), ставите га у 20 μл Плант Дирецт Лисис пуфер А и загревајте га на 95°Ц 5 – 10 мин.Време лизе се може на одговарајући начин продужити за листове које је тешко лизирати (не више од 20 мин).Ако се користе веће количине ткива листа (не прелазе 7 мм), повећајте запремину пуфера за разблаживање на 50 μл.Након загревања, кратко центрифугирајте и додајте 1 μл супернатанта у ПЦР систем као реакциони шаблонб.

Обрада узорка– Семе биљке

Метода лизе млевења:Користите скалпел да исечете семена пречника 5 мм, додајте их у 100 μл Плант Дирецт Лисис пуфера А и измрвите узорак врхом пипете или другим алатима.Кратко промешати и оставити да одстоји на собној температури 3 – 5 мин.Уверите се да је узорак семена потопљен у пуфер за разблаживање.После кратког центрифугирања, додајте 1 μл супернатанта у ПЦР систем као реакциони шаблон.

Метода термичке лизе:Користите скалпел да исечете семена пречника 5 мм, додајте их у 100 μл Плант Дирецт Лисис пуфера А и загревајте на 95°Ц 5 – 10 мин.Време лизе се може на одговарајући начин продужити за листове које је тешко лизирати (не више од 30 мин).Након загревања, кратко центрифугирајте и додајте 1 μл супернатанта у ПЦР систем као реакциони шаблонб.

а.Маказе или други алати се такође могу користити за сечење узорака одговарајуће величине;ако се бушилица или маказе поново користе, треба их очистити са 2% раствором натријум хипохлорита пре сваке употребе да би се спречила унакрсна контаминација између узорака.

б.Уверите се да је пуфер за директну лизу биљака потпуно истопљен пре употребе.Ако је пуфер вискозан или има талог, може се загрејати на 37 ℃ да би се потпуно растопио пре употребе.

ц.Запремина шаблона у реакционом систему може се подесити на одговарајући начин према разлици у запремини биљног материјала и додатог разблаживача.

Пуфер за директну лизу биљака

Пуфер за директну лизу биљака А садржан у овом производу је стриктно оптимизован за ослобађање генома већине биљних ткива и погодан је за краткотрајно складиштење сирових биљака на 4℃.Ако узорак треба да се чува дужи временски период (нпр. 1 – 2 месеца), препоручује се да се супернатант пребаци у нову ЕП епрувету и чува на -20℃.Да бисте стабилније чували узорке, додајте једнаку запремину пуфера за директну лизу биљака Б у пренети супернатант, добро промешајте и чувајте на -20 ℃.Стабилно време складиштења варира у зависности од биљних узорака и стања.

Реакциони систем

а.Садржи Мг²⁺при коначној концентрацији од 2 мМ.

б.Препоручује се употреба коначне концентрације од 0,4 μМ за сваки прајмер.Прекомерна употреба прајмера ће довести до повећаног неспецифичног појачања.

ц.Количина коришћеног узорка може се прилагодити према стварној ситуацији.Количина која се користи у једној реакцији сировог лизираног узорка може се подесити између 2% – 20% укупне запремине реакције.Коришћење превише узорака може довести до неуспеха појачања.

Програм реаговања

а.Почетна денатурација (98℃, 5 мин) промовише лизу биљног ткива, ослобађајући геномску ДНК која се може користити за ПЦР амплификацију.Немојте скраћивати време или снижавати температуру.

б.Препоручује се да се подеси на вредност прајмера Тм или 2 ~ 4℃ више од вредности Тм.ДНК полимераза за директно појачање која се користи у овом производу разликује се од конвенционалне Так ДНК полимеразе и има посебне захтеве за температуру реакционог жарења; употреба високе температуре жарења може ефикасно смањити неспецифично појачање и побољшати ефикасност амплификације.За сложене шаблоне, ефикасно појачање се може постићи подешавањем температуре жарења и продужењем времена продужетка.

ц.Ако је дужина производа за појачавање ≤1 кб, време продужења је подешено на 30 сек/кб;ако је дужина производа за појачавање >1 кб, време продужења је подешено на 60 сек/кб.

д.За сложене узорке или узорке са ниским приносом амплификације, број циклуса се може на одговарајући начин повећати на 40 -50 циклуса.

Апликације

Применљив је за директно појачавање биљних ткива и високо пропусни скрининг биљних узорака који не садрже полисахариде и полифеноле.

Напомене

Само за истраживачку употребу.Није за употребу у дијагностичким процедурама.

1. За амплификацију сирове биљке или директно амплификацију, препоручује се коришћење пречишћене геномске ДНК као позитивне контроле пре почетка експеримента како би се осигурало да су систем, прајмери ​​и операције исправни.

2. Директна амплификациона ДНК полимераза која се користи у овом комплету има снажну лекторску активност.Ако је потребно извршити ТА клонирање, препоручује се пречишћавање ДНК пре додавања аденина.

3. Упутство за дизајн прајмера:

а.Препоручује се да последња база на 3′ крају прајмера буде Г или Ц.

б.Треба избегавати узастопна неслагања у последњих 8 база на 3′ крају прајмера.ц.Избегавајте структуре укосница на 3′ крају прајмера.

д.Разлике у вредности Тм предњег прајмера и обрнутог прајмера не би требало да буду веће од 1℃, а вредност Тм треба да се подеси на 60 ~ 72℃ (Препоручује се Пример Премиер 5 за израчунавање вредности Тм).

е.Додатне додатне секвенце прајмера које се не подударају са шаблоном не би требало да буду укључене приликом израчунавања вредности Тм прајмера.

ф.Препоручује се да ГЦ садржај прајмера буде 40% -60%.

г.Укупна дистрибуција А, Г, Ц и Т у прајмеру треба да буде што је могуће равномернија.Избегавајте коришћење региона са високим садржајем ГЦ или АТ.

х.Избегавајте присуство комплементарних секвенци од 5 или више база било унутар прајмера или између два прајмера и избегавајте присуство комплементарних секвенци од 3 или више база на 3′ крају два прајмера.

и.Користите функцију НЦБИ БЛАСТ да проверите специфичност прајмера да бисте спречили неспецифично појачање.