Протеиназа К НГС (прах)
Каталошки број: ХЦ4507А
НГС протеаза К је стабилна серинска протеаза са високом ензимском активношћу и широком специфичношћу супстрата. Ензим првенствено разлаже естарске везе и пептидне везе у близини Ц-терминала хидрофобних амино киселина, амино киселина које садрже сумпор и ароматичних амино киселина.Дакле, често се користи за разградњу протеина у кратке пептиде.НГС протеаза К је типична серинска протеаза са Асп39-Његов69-Сер224каталитичка тријада која је јединствена за серинске протеазе, а каталитички центар је окружен вучом Ца2+места везивања за стабилизацију, одржавајући високу активност ензима у ширем спектру услова.
Спецификација
| Изглед | Бели до готово бели аморфни прах, лиофилизован |
| Специфична активност | ≥40У/мг чврсте супстанце |
| ДНасе | Није откривено |
| РНасе | Није откривено |
| Биобурден | ≤50ЦФУ/г чврсте супстанце |
| Остатак нуклеинске киселине | <5 пг/мг чврсте супстанце |
Својства
| Извор | Тритирацхиум албум |
| ЕЦ број | 3.4.21.64(Рекомбинант из албума Тритирацхиум) |
| Молекуларна тежина | 29 кДа (СДС-ПАГЕ) |
| Изоелектрична тачка | 7.81 Сл.1 |
| Оптимални пХ | 7,0-12,0 (Сви имају високу активност) Сл.2 |
| Оптимална температура | 65℃ Сл.3 |
| пХ стабилност | пХ 4,5-12,5 (25℃,16х) Сл.4 |
| Термичка стабилност | Испод 50℃ (пХ 8,0, 30 мин) Сл.5 |
| Стабилност складиштења | Чувано на 25℃ 12 месеци Сл.6 |
| Активатори | СДС, уреа |
| Инхибитори | Диизопропил флуорофосфат;бензилсулфонил флуорид |
Услови складиштења
Чувајте лиофилизовани прах на -25~-15 ℃ дуго времена далеко од светлости;Након растварања, аликвот у одговарајућу запремину за краткотрајно складиштење на 2-8℃ далеко од светлости или дуготрајно складиштење на -25~-15 ℃ далеко од светлости.
Превентивне мере
Носите заштитне рукавице и заштитне наочаре када користите или вагате, и добро проветрите након употребе.Овај производ може изазвати алергијску реакцију коже и озбиљну иритацију очију.Ако се удише, може изазвати алергију или симптоме астме или диспнеју.Може изазвати иритацију дисајних путева.
Дефиниција јединице
Једна јединица НГС протеазе К је дефинисана као количина ензима потребна за хидролизу казеина у 1 μмол Л-тирозина под стандардним условима одређивања.
Припрема реагенса
| Реагенс | Произвођач | Каталог |
| Казеин техничкиод говеђег млека | Сигма Олдрицх | Ц7078 |
| НаОХ | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 10019762 |
| НаХ2PO4·2Х2O | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 20040718 |
| На2ХПО4 | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 20040618 |
| Трихлоросирћетна киселина | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 80132618 |
| Натријум ацетат | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 10018818 |
| Сирћетна киселина | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 10000218 |
| ХЦл | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 10011018 |
| Натријум карбонат | Синопхарм ЦхемицалРеагент Цо., Лтд. | 10019260 |
| Фолин-фенол | Сангон Биотецх (Шангај)Цо., Лтд. | А500467-0100 |
| Л-тирозин | Сигма | 93829 |
Реагенс И:
Супстрат: 1% казеин из раствора говеђег млека: растворити 1 г казеина говеђег млека у 50 мл 0,1 М раствора натријум фосфата, пХ 8,0, загревати у воденом купатилу на 65-70 °Ц 15 минута, мешати и растворити, охладити водом, подесити помоћу натријум хидроксида до пХ 8,0 и разблажити у 100 мл.
Реагенс ИИ:
ТЦА раствор: 0,1 М трихлорсирћетне киселине, 0,2 М натријум ацетата и 0,3 М сирћетне киселине (измерити 1,64 г трихлорсирћетне киселине + 1,64 г натријум ацетата + 1,724 мЛ сирћетне киселине узастопно, додати 50 мЛ дејонизоване воде и подесити пХ са 4.ХЦл до 3 100мл).
Реагенс ИИИ:
0,4 м раствора натријум карбоната (измерити 4,24 г анхидрованог натријум карбоната и растворити у 100 мЛ воде)
Реагенс ИВ:
Фолин фенол реагенс: разблажити 5 пута дејонизованом водом.
Реагенс В:
Ензимски разблаживач: 0,1 М раствор натријум фосфата, пХ 8,0.
Реагенс ВИ:
Стандардни раствор Л-тирозина: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл Л-тирозин растворен са 0,2 М ХЦл.
Процедура
1. Укључите УВ-Вис спектрофотометар и изаберите фотометријско мерење.
2. Подесите таласну дужину на 660нм.
3. Укључите водено купатило, подесите температуру на 37℃, обезбедите да температура остане непромењена 3-5 минута.
4. Претходно загрејте 0,5 мЛ супстрата у епрувети за центрифугирање од 2 мЛ на 37 ℃ воденом купатилу 10 минута.
5. Екстрахујте 0,5 мЛ разблаженог раствора ензима у претходно загрејану епрувету за центрифугирање 10 минута.Поставите ензимски разблаживач као празну групу.
6. Додајте 1,0 мЛ ТЦА реагенса одмах након реакције.Добро промешајте и инкубирајте у воденом купатилу 30 минута.
7. Центрифугирајте реакциони раствор.
8. Додајте следеће компоненте наведеним редоследом.
| Реагенс | Волуме |
| Супернатант | 0,5 мЛ |
| 0,4 М натријум карбоната | 2,5 мЛ |
| Фолин фенол реагенс | 0,5 мЛ |
9. Добро промешајте пре инкубације у воденом купатилу на 37℃ током 30 минута.
10. ОД660одређена је као ОД1;празна контролна група: Ензимски разблаживач се користи за замену раствора ензима за одређивање ОД660као ОД2, ΔОД=ОД1-ОД2.
11. Стандардна крива Л-тирозина: 0,5 мЛ раствора Л-тирозина различите концентрације, 2,5 мЛ 0,4 М натријум карбоната, 0,5 мЛ Фолин фенол реагенса у епрувети за центрифугирање од 5 мЛ, инкубирајте на 37 ℃ 30 минута, откријте ОД660за различите концентрације Л-тирозина, тада се добија стандардна крива И=кКс+б, где је И концентрација Л-тирозина, Кс је ОД600.
Калкулација
2: Укупна запремина реакционог раствора (мЛ)
0,5: Запремина раствора ензима (мЛ)
0,5: Запремина реакционе течности која се користи за хромогено одређивање (мЛ)
10: Време реакције (мин)
Df: Вишеструко разблаживање
C: Концентрација ензима (мг/мЛ)
Фигурес
Сл.1 ДНК остатак
| Узорак | Аве C4 | Нуклеинске киселине Опоравак (пг/мг) | Опоравак(%) | Тотал Нуцлеиц киселина ( пг/мг) |
| ПРК | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| ПРК+СТД2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| СТД1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| СТД2 | 16 | |||
| СТД3 | 19.125 | |||
| СТД4 | 23.135 | |||
| СТД5 | 26.625 | |||
| Х2О без РНК | Неодређено | — | — | — |
Слика 2 Оптимални пХ
Сл.3 Оптимална температура
Слика 4 пХ стабилност
Сл.5 Термичка стабилност
Слика 6 Стабилност складиштења на 25℃
