ЕндоФрее Пласмид Маки комплет

Услови складиштења

РНАсеА треба чувати на -30 ~ -15 ℃ и транспортовати на ≤ 0 ℃.

Ендотоксин Сцавенгер се може чувати на 2 ~ 8 ℃ током једног месеца, чувати на -30 ~ -15 ℃ за дуготрајно складиштењеи транспортован на ≤0℃.

Остале компоненте треба чувати на собној температури (15 ~25 ℃) и транспортовати на собној температури.

Компоненте

РНАсеА:10 мг/мл, који се користи за уклањање РНК.

Бафер П1:пуфер за бактеријску суспензију, додајте РНАсеА у пуфер П1 пре прве употребе.

Бафер П2:пуфер за бактеријску лизу (који садржи СДС/НаОХ).

Пуфер П4:неутрализујући пуфер.

Чистач ендотоксина:ефикасно уклања ендотоксин из сировог екстракта плазмида.

Буффер ПВ:пуфер за прање, додајте прописану запремину етанола пре прве употребе.

Буффер ТБ:елуциони пуфер.

ФастПуре ДНК Маки колоне:колоне за адсорпцију плазмидне ДНК.

Тубе за сакупљање 50 мл:цеви за сакупљање филтрата.

Цев за сакупљање без ендотоксина:епрувете за сакупљање плазмидне ДНК.

Припремљени материјали

Апсолутни етанол, изопропанол, епрувете за центрифугирање са округлим дном од 50 мл и 50 мл без ендотоксинацентрифугалне цеви.

Апликације

Овај производ је погодан за велику екстракцију плазмида од 150 - 300 мл бактеријског растворакултивисан преко ноћи.

Експеримент процес

1. Узмите 150 – 200 мл (не више од 300 мл) бактеријског раствора култивисаног преко ноћи и центрифугирајте наоко 11.000 о/мин (12.000 × г) током 1 – 2 мин.Одбаците супернатант и сакупите бактерије.

Δ Када се сакупља више од 50 мл бактеријског раствора, бактерије се могу сакупити додавањем бактеријског раствора, центрифугирањем, одбацивањем супернатанта и другим корацима у исту епрувету од 50 мл за

више пута.

2. Додајте 7,5 мл пуфера П1 (молимо проверите да ли је РНАсеА додата пуферу П1) у центрифугуепрувету која садржи бактерије и добро промешати вортексом или пипетом.

Δ Потпуна ресуспензија бактерија у овом кораку је критична за принос и не би требало бити бактеријских грудвица након ресуспензије.Ако постоје грудвице бактерија које нису добро измешане, то ће утицати на лизу, што ће резултирати ниским приносом и чистоћом.Ако је ОД600 бактеријског раствора 0,65, препоручује се да се користи 7,5 мл пуфера П1 за екстракцију из 150 мл раствора бактерија;када је ОД600 0,75, треба користити 8 мл пуфера П1 и у складу са тим променити запремине пуфера П2 и П4.Ако се запремина бактеријског раствора повећа на 200 мл, препоручује се да сезапремина пуфера П1, П2 и П4 се пропорционално повећава.

3. Додајте 7,5 мл пуфера П2 у бактеријску суспензију из корака 2 и лагано мешајте горе-доле 6 – 8пута и инкубирајте на собној температури 4 – 5 мин.

Δ Лагано окрените да бисте добро промешали.Вортекинг ће изазвати фрагментацију геномске ДНК, што ће резултирати фрагментима геномске ДНК у екстрахованом плазмиду.У овом тренутку, раствор постаје вискозан и провидан, што показује да су бактерије потпуно лизиране.Трајање не би требало да прелази 5 минута да би се избегло уништавање плазмида.Ако раствор није бистар, може доћи до превише бактеријанепотпуна лиза, па количину бактерија треба на одговарајући начин смањити.

4. Додајте 7,5 мл пуфера П4 у бактеријску суспензију из корака 3 и одмах лагано окрените 6 – 8 пута како бисте омогућили раствору да потпуно неутралише пуфер П2.У овом тренутку треба да се појави бели флокулантни талог.Центрифугирајте на више од око 11.000 о/мин (12.000 × г) 10 – 15 минута, пажљиво пипетирајте супернатант у нову епрувету за центрифугирање са округлим дном од 50 мл (самоприпремљену) и избегавајтеаспирирајте плутајући бели талог.

Δ Додајте пуфер П4 и одмах окрените да се добро измеша.Оставите епрувету да стоји док се бели талог не распореди равномерно по раствору како би се спречило стварање локалних падавина које би могле утицати на неутрализацију.Ако нема равномерног белог флокулентног талога пре центрифугирања и супернатант није бистар након центрифугирања, епрувета се можецентрифугиран још 5 мин.

5. Додајте 0,1 пута запремину (10% запремине супернатанта, око 2,2 мл) Ендотоксин Сцавенгер у супернатант из корака 4 и окрените да се меша.Ставите раствор у ледено купатило или га убаците у здробљени лед (или замрзивач у фрижидеру) на 5 минута док се раствор не промени из замућеног у бистар и провидан (или још увекблаго замућен), и повремено промешати неколико пута.

Δ Након што се чистач ендотоксина дода супернатанту, супернатант ће постати замућен, алисупернатант треба да постане бистар (или благо замућен) након хлађења у леденом купатилу.

6. Након што се супернатант стави на собну температуру (>25℃) у трајању од 10 – 15 минута, постаће мутан каотемпература му се повећава на собну температуру.Затим супернатант треба преокренути да се меша.

Δ Ако је собна температура нижа или желите да скратите време екстракције, супернатант се може инкубирати у воденом купатилу на 37 ~ 42 ℃ 5 – 10 минута и следећи корак се може извести након супернатантапостаје замућен.

7. Центрифугирајте супернатант на око 11.000 рпм (12.000 × г) 10 минута на собној температури (температура мора бити >25 ℃) да бисте одвојили фазу.Горња водена фаза садржи ДНК, док доњи плави слој уљане фазе садржи ендотоксин и друге нечистоће.Трансфер тхеводену фазу која садржи ДНК у нову епрувету иодбаците масни слој.

Δ Температура током центрифугирања мора бити преко 25 ℃ јер ефективно раздвајање фаза нијенастају ако је температура прениска.

Δ Ако раздвајање фаза није ефикасно, температура центрифугирања се може подесити на 30℃ ивреме центрифугирања се може повећати на 15 мин.

Δ Немојте сисати плави масни слој јер садржи ендотоксин и друге нечистоће.

Механизам

Неутрализација лизе ресуспензије

◇ Додајте 7,5 мл пуфера П1

◇ Додајте 7,5 мл пуфера П2

◇ Додајте 7,5 мл пуфера П4

Уклањање ендотоксина

◇Додајте 0.1 пута запремину супернатанта Ендотоксин Сцавенгер-а

Везивање и прање

◇ Додајте 0,5 пута запремину изопропанола

◇ Додајте 10 мл пуфера ПВ