М-МЛВ Неосцрипт реверзна транскриптаза
Неосцрипт реверзна транскриптаза је реверзна транскриптаза добијена скринингом мутације М-МЛВ гена порекла и експресије вируса Молонеи мишје леукемије у Е.цоли.Ензим уклања активност РНазе Х, има већу температурну толеранцију и погодан је за реверзну транскрипцију на високим температурама.Стога је од помоћи за елиминисање неповољних ефеката структуре високог нивоа РНК и неспецифичних фактора на синтезу цДНК, и има већу стабилност и способност синтезе реверзне транскрипције.Ензим има већу стабилност и способност синтезе реверзне транскрипције.
Компоненте
1.200 У/μЛ Неосцрипт реверзна транскриптаза
2.5 × пуфер првог ланца (опционо)
* 5 × пуфер првог ланца не садржи дНТП, додајте дНТП када припремате реакциони систем
Препоручена апликација
1.кРТ-ПЦР у једном кораку.
2.Детекција РНК вируса.
Кондиција складишта
-20°Ц за дуготрајно складиштење, треба добро промешати пре употребе, избегавати често замрзавање-одмрзавање.
Дефиниција јединице
Једна јединица садржи 1 нмол дТТП за 10 минута на 37°Ц коришћењем поли(А)•олиго(дТ)25као шаблон/прајмер.
Контрола квалитета
1.СДС-ПАГЕ електрофоретска чистоћа већа од 98%.
2.Осетљивост појачања, контрола од серије до серије, стабилност.
3.Нема активности егзогене нуклеазе, нема егзогене ендонуклеазе или контаминације егзонуклеазом
Реацтион Сетуп фор Фирст Цхаин Реацтион Солутион
1.Припрема реакционе смеше
| Компоненте | Волуме |
| олиго(дТ)12-18 Пример или Рандом Примера Или генски специфични прајмериb | 50 пмол |
| 50 пмол (20-100 пмол) | |
| 2 пмол | |
| 10 мМ дНТП | 1 μЛ |
| Темплате РНА | Укупна РНК≤ 5μг;мРНА≤ 1 μг |
| дХ без РНазе2O | До 10 μЛ |
напомене:а/б: Молимо изаберите различите типове прајмера у складу са вашим експерименталним потребама.
2.Загревајте на 65°Ц 5 минута и брзо охладите на леду 2 минута.
3.Додајте следеће компоненте у горњи систем до укупне запремине од 20µЛ и лагано промешајте:
| Компоненте | Волумен (μЛ) |
| 5 × пуфер првог ланца | 4 |
| Неосцрипт реверзна транскриптаза (200 У/μЛ) | 1 |
| Инхибитор РНазе (40 У/μЛ) | 1 |
| дХ без РНазе2O | До 20 μЛ |
4. Извршите реакцију у складу са следећим условима:
(1) Ако се користи Рандом Пример, реакција треба да се изведе на 25℃ током 10 минута, а затим на 50℃ током 30~60 минута;
(2) Ако се користи Олиго дТ или специфични прајмери, реакција треба да се изведе на 50℃ током 30~60 минута.
5.Загревајте на 95 ℃ 5 минута да бисте инактивирали Неосцрипт реверзну транскриптазу и прекинули реакцију.
6.Производи реверзне транскрипције могу се користити директно у ПЦР реакцији и флуоресцентној квантитативној ПЦР реакцији, или се чувати на -20 ℃ дуго времена.
ПЦР Ракција:
1.Припрема реакционе смеше
| Компоненте | Концентрација |
| 10 × ПЦР пуфер (без дНТП, без Мг²+) | 1× |
| дНТП (10мМ сваки дНТП) | 200 μМ |
| 25 мМ МгЦл2 | 1-4 мМ |
| Так ДНК полимераза (5У/μЛ) | 2-2,5 У |
| Прајмер 1 (10 μМ) | 0,2-1 μМ |
| Прајмер 2 (10 μМ) | 0,2-1 μМ |
| Темплатеа | ≤10% раствор прве ланчане реакције (2 μЛ) |
| ддХ2O | До 50 μЛ |
напомене:а: Ако се дода превише раствора прве ланчане реакције, ПЦР реакција може бити инхибирана.
2.ПЦР Реацтион Процедуре
| Корак | Температура | време | Циклуси |
| Пре-денатурација | 95℃ | 2-5 мин | 1 |
| Денатурација | 95℃ | 10-20 сец | 30-40 |
| Жарење | 50-60℃ | 10-30 сец | |
| Продужетак | 72℃ | 10-60 сец |
Напомене
1.Погодно за оптимизацију температуре реверзне транскрипције у опсегу од 42℃~55℃.
2.Има бољу стабилност, погодан је за високотемпературно појачање реверзне транскрипције.Поред тога, повољан је за ефикасно пролазак кроз сложене структурне регионе РНК.Такође, тоје погодан за квантитативну РТ-ПЦР детекцију мултиплексне флуоресценције у једном кораку.
3.Добра компатибилност са различитим ензимима ПЦР амплификације и погодан је за РТ-ПЦР реакције високе осетљивости.
4.Погодно за квантитативну РТ-ПЦР реакцију флуоресценције високе осетљивости у једном кораку, ефикасно побољшава стопу детекције ниске концентрације шаблона.
5.Погодно за изградњу цДНК библиотеке.
