Мини комплет за екстракцију ДНК
Овај комплет усваја оптимизовани систем пуфера и технологију пречишћавања колоне силика гела, која може да поврати фрагменте ДНК од 70 бп – 20 кб из различитих концентрација ТАЕ или ТБЕ агарозног гела.Колона за адсорпцију ДНК може посебно адсорпирати ДНК под високим садржајем соли.Поред тога, комплет може директно пречистити фрагменте ДНК из ПЦР производа, ензимских реакционих система или сирових ДНК производа добијених другим методама и уклонити нечистоће као што су протеини, друга органска једињења, јони неорганске соли и олигонуклеотидни прајмери.Може осигурати да се пречишћавање може завршити у року од 10-15 минута.Пречишћена ДНК се може користити директно за лигацију, трансформацију, варење ензима, ин витро транскрипцију, ПЦР, секвенцирање, микроињекцију итд.
Услови складиштења
Чувати на -15 ~ -25 ℃ и транспортовати на собној температури.
Компоненте
| Компоненте | (100 ркнс) |
| Буффер ГДП | 80 мл |
| Буффер ГВ | 2 × 20 мл |
| Пуфер за елуирање | 20 мл |
| ФастПуре ДНК Мини Цолумнс-Г | 100 |
Буфер БДП:Пуфер за везивање ДНК.
Буффер ГВ:пуфер за прање;пре употребе додајте апсолутни етанол до назначене запремине на боци.
Пуфер за елуирање:Елуција.
ФастПуре ДНК Мини Цолумнс-Г:ДНК адсорпционе колоне.
Тубе за сакупљање 2 мл:Епрувете за сакупљање филтрата.
Припремљени материјали
1,5 мл стерилизоване епрувете, апсолутни етанол и изопропанол (када фрагмент ДНК ≤100 бп, додајте 1 запремину
изопропанол до 1 запремине гела), водено купатило.
Експеримент процес
Додајте 80 мл етанола да разблажите пуфер ГВ као што је назначено на етикети пре употребе, чувајте на собној температури.
Механизам
1. ПЦР реакциони раствор
Шема екстракције гела: Додајте једнаку запремину пуфера ГДП ПЦР реакционог раствора шеме за опоравак:Додајте 5 пута већи волумен пуфера
2. БДП Израчунајте запремину гела (100 μл је 100 мг)
Растворити гел
3. Претходно загрејати на 50 ~ 55℃
4. Бинд Васх
Додајте 300 μЛ Буффер ГДП*
Додајте 700 μЛ пуфера ГВ
Додајте 700 μЛ пуфера ГВ
5. Елуте
Додајте 20 – 30 μЛ пуфера за елуирање или дејонизоване воде
Напомене* Опоравак течности ПЦР реакције без овог корака
Програм екстракције гела
1. После ДНК електрофорезе за фракционисање фрагмената ДНК, изрежите једну траку ДНК фрагмента из агарозног гела под УВ светлом.Препоручује се употреба упијајућег папира да апсорбује привидну влагу гела и минимизира величину кришке гела уклањањем додатне агарозе колико год можете.Измерите кришку гела (без епрувете за микроцентрифугу) да бисте израчунали њену запремину: Запремина од 100 мг гела је приближно 100 μЛ, под претпоставком да је густина 1 г/мл.
2. Додајте једнаку запремину пуфера ГДП, инкубирајте на 50~55℃ 7-10 мин (према величини гела, подесите време инкубације док се гел потпуно не раствори).Окрените епрувету 2 пута током инкубације.
Δ Додавање 1-3 запремине Буффер ГДП-а неће утицати на ефикасност опоравка ДНК.Ако фрагмент ДНК који треба да се поврати <100 бп, потребно је додати 3 запремине Буффер ГДП;када се кришка гела потпуно раствори, додајте 1 запремину изопропанола и добро промешајте, а затим наставите на следећи корак.
3. Центрифугирајте кратко да бисте довели узорак на дно епрувете, уметните ФастПуре ДНК Мини Цолумнс-Г у епрувете за сакупљање 2 мл, пажљиво пребаците раствор од максимално 700 μЛ једном дневно
време до филтрационих колона, центрифугирати на 12.000 рпм (13.800 Кс г) 30-60 секунди.
4. Одбаците филтрат и додајте 300 μЛ пуфера ГДП у колону, инкубирајте на собној температури 1 мин, центрифугирајте на 12.000 рпм (13.800 Кс г) 30-60 секунди.
5. Одбаците филтрат и додајте 700 μЛ пуфера ГВ (проверите да ли је апсолутни етанол додат унапред!) у колону, центрифугирајте на 12.000 рпм (13.800 Кс г) 30-60 секунди.
Δ Додајте пуфер ГВ око зида адсорпционе колоне или додајте задњи поклопац пуфера ГВ и мешајте га наопако 2 – 3 пута да бисте потпуно испрали со која се залепила за зид цеви.
6. Поновите корак 5.
Δ Испирање пуфером ГВ два пута може осигурати да се со потпуно уклони и елиминише утицај на наредне експерименте.
7. Одбаците филтрат и центрифугирајте празну колону на 12.000 рпм (13.800 Кс г) 2 мин.
8. Убаците колону у чисту епрувету за микроцентрифугу од 1,5 мл, додајте 20 - 30 μЛ пуфера за елуирање у центар мембране колоне, инкубирајте 2 минута, а затим центрифугирајте на 12.000 рпм (13.800 Кс г) током 1 мин.Одбаците колону, сачувајте добијену ДНК на -20°Ц.
Δ Преношење супернатанта из корака 8 у колону да се поново елуира и претходно загревање пуфера за елуирање на 55 (када фрагмент ДНК >3 кб) може помоћи да се повећа ефикасност опоравка.
Програм за опоравак ПЦР производа
Овај протокол је применљив за пречишћавање ДНК фрагмената из ПЦР производа, ензимског реакционог система и других сирових производа ДНК (укључујући генетску ДНК).Овај раствор може ефикасно уклонити различите нуклеотиде, прајмере, димере прајмера, молекуле соли, ензиме и друге нечистоће.
1. Укратко центрифугирајте ПЦР производе, ензимски реакциони раствор и друге сирове ДНК производе.Процените њихову запремину пипетом и пренесите у стерилизовану епрувету од 1,5 мл или 2 мл.Додати ддХ2О до запремине од 100 μЛ;док ће за геномску ДНК са високом концентрацијом, разблаживање на 300 μЛ са ддХ2О помоћи да се побољша ефикасност опоравка.
2. Додајте 5 запремина Буффер ГДП-а, добро промешајте инвертовањем или мешањем на вортекс.Ако је ДНК фрагмент од интереса >100 бп, потребно је додати додатних 1,5 запремине (узорци + пуферски БДП) етанола.
3. Вратите колону у епрувету за сакупљање, пренесите мешавину у колону, центрифугирајте на 12.000 рпм (13.800 × г) 30 – 60 секунди.Ако је запремина мешаног раствора >700 µЛ, вратите адсорпциону колону у епрувету за сакупљање, пренесите преостали раствор у адсорпциону колону и центрифугирајте на 12.000 рпм (13.800 × г) 30 – 60 секунди.
4. Следећи учинак се односи на кораке 5 – 8 програма 08-1/Екстракција гела.
Апликације
Различите концентрације ТАЕ или ТБЕ агарозног гела;ПЦР производи, ензимски реакциони системи или други сирови ДНК производи добијени различитим методама.Пронађени фрагменти су варирали од70 бп -20 кб.
Напомене
Само за истраживачку употребу.Није за употребу у дијагностичким процедурама.
1. Додајте 80 мл етанола да разблажите пуфер ГВ као што је назначено на етикети пре употребе, чувајте на собној температури.
2. Ако се пуферски БДП лако таложи током складиштења на ниској температури, може се ставити на собну температуру на одређено време пре употребе.Ако је потребно, може се претходно загрејати у воденом купатилу на 37℃ док се талог потпуно не раствори, а затим се може користити након мешања.
3. Подесите температуру воденог купатила на 50 ~ 55℃ унапред.
4. У 1. кораку програма екстракције 08-1/гела, минимизирање величине пресека гела ће значајно смањити време растварања и повећати ефикасност опоравка (Линеаризована ДНК се лако хидролизује када је стално изложена високој температури).Не излажите ДНК гел УВ зрачењу дуго времена, јер ултраљубичасто светло може изазвати оштећење ДНК.
5. У потпуности растворите гел у кораку 2 програма екстракције 08-1/Гел, иначе ће ефикасност опоравка ДНК бити озбиљно угрожена.
6. Загрејте пуфер за елуирање или ддХ2О на 55℃, што је корисно за побољшање ефикасности елуирања ДНК.Препоручује се чување ДНК у елуенту од 2,5 мМ Трис-ХЦл, пХ 7,0 – 8,5.
