РТЛ реверзна транскриптаза
РТЛ реверзна транскриптаза је ДНК полимераза зависна од РНК шаблона којој недостаје активност 3'→5' егзонуклеазе и има активност РНазе Х.Овај ензим може да користи РНК као шаблон за синтезу комплементарног ланца ДНК, који се може применити на синтезу цДНК првог ланца, посебно за РТ-ЛАМП (изотермална амплификација посредована петљом).У поређењу са РТЛ реверзном транскриптазом 1.0, осетљивост је значајно побољшана, термичка стабилност је јача, а реакција на 65°Ц је стабилнија.РТЛ реверзна транскриптаза (без глицерола) се може користити за припрему лиофилизованих препарата, лиофилизованих РТ-ЛАМП реагенса итд.
Дефиниција јединице
Једна јединица уграђује 1 нмол дТТП-а у материјал који се може таложити у киселини за 20 минута на 50°Ц користећи поли(А)•олиго(дТ)25 као шаблон-прајмер.
Компоненте
| Саставни део | ХЦ5008A-01 | ХЦ5008A-02 | ХЦ5008A-03 |
| РТЛ реверзна транскриптаза (без глицерола) (15У/μЛ) | 0,1 мЛ | 1 мЛ | 10 мЛ |
| 10×ХЦ РТЛ бафер | 1,5 мЛ | 4×1,5 мЛ | 5×10 мЛ |
| МгСО4 (100мМ) | 1,5 мЛ | 2×1,5 мЛ | 3×10 мЛ |
Кондиција складишта
Транспортовати на 0°Ц и чувати на -25°Ц~-15°Ц.
Контрола квалитета
- Преостала активност одEдонуклеаза:Реакција од 50 μЛ која садржи 1 μг λДНК и 15 јединица РТЛ2.0 инкубираних 16 сати на 37 ℃ показује исти образац као негативна контрола гел електрофорезом.
- Преостала активност одЕгзонуклеаза:Реакција од 50 μЛ која садржи 1 μг Хинд Ⅲ дигестиране λДНК и 15 јединица РТЛ2.0 инкубираних 16 сати на 37 ℃ показује исти образац као негативна контрола гел електрофорезом.
- Преостала активност одНицкасе:Реакција од 50 μЛ која садржи 1 μг суперзамотаног пБР322 и 15 јединица РТЛ2.0 инкубираних 4 сата на 37 ° Ц показује исти образац као негативна контрола гел електрофорезом.
- Преостала активност одРНасе:Реакција од 10 μЛ која садржи 0,48 μг МС2 РНК и 15 јединица РТЛ2.0 инкубираних 4 сата на 37°Ц показује исти образац као негативна контрола гел електрофорезом.
- Е. цоли gДНК:Мерено саЕ.цолиспецифични ХЦД комплети за детекцију, 15 јединица РТЛ2.0 садржи мање од 1Е. цолигеном.
Реацтион Сетуп
цДНК Синтхесис Протоцол
| Компоненте | Волуме |
| Шаблон РНК а | опционо |
| Олиго(дТ) 18~25(50уМ) или насумична мешавина прајмера (60уМ) | 2 μЛ |
| дНТП мешавина (10мМ сваки) | 1 μЛ |
| Инхибитор РНазе (40У/уЛ) | 0,5 μЛ |
| РТЛ реверзна транскриптаза 2.0 (15У/уЛ) | 0,5 μЛ |
| 10×ХЦ РТЛ бафер | 2 μЛ |
| Вода без нуклеаза | До 20 μЛ |
напомене:
1) Препоручена доза укупне РНК је 1нг~1μг
2) Препоручена доза мРНА била је 50нг~100нг
Тхермо-бициклизам Услови за рутину реакција:
| температура (°Ц) | време |
| 25 °Цa | 5минс |
| 55 °Ц | 10 минb |
| 80 °Ц | 10 мин |
напомене:
1) Ако се користи Рандом Пример Мик, корак инкубације на 25°Ц.
2) Ако се користи циљна мешавина прајмера, корак инкубације на 55°Ц у трајању од 10~30 минута.
РТ-ЛАМП протокол
| Компоненте | Волуме | Коначна концентрација |
| Темплате РНА | опционо | ≥10 копија |
| дНТП мешавина (10мМ) | 3,5 μЛ | 1,4 мМ |
| ФИП/БИП прајмери (25×) | 1 μЛ | 1,6 μМ |
| Ф3/Б3 прајмери (25×) | 1 μЛ | 0,2 μМ |
| ЛоопФ/ЛоопБ прајмери (25×) | 1 μЛ | 0,4 μМ |
| Инхибитор РНазе (40У/μЛ) | 0,5 μЛ | 20 У/Реакција |
| РТЛ реверзна транскриптаза 2.0 (15У/μЛ) | 0,5 μЛ | 7.5 У/Реакција |
| Бст В2 ДНК полимераза (8У/μЛ) | 1 μЛ | 8 У/Реакција |
| МгСО4 (100мМ) | 1,5 μЛ | 6 мМ (укупно 8 мМ) |
| 10×ХЦ РТЛ бафер (или 10×ХЦ Бст В2 бафер) | 2,5 μЛ | 1 × (2мМ Мг2+) |
| Вода без нуклеаза | До 25 μЛ | - |
напомене:
1) Мешајте мешањем на вортексу и кратко центрифугирајте да се сакупи.Инкубација на константној температури на 65°Ц током 1 сата.
2) Два бафера су интероперабилна и имају исти састав.
Напомене
1. Овај производ ће формирати белу чврсту супстанцу када се чува на -20 °Ц.Извадите га са -20°Ц и ставите на лед око 10 минута.Након топљења може се користити мућкањем и мешањем.
2. цДНК производ се може чувати на -20°Ц или -80°Ц или одмах користити за ПЦР реакцију.
3. Да бисте спречили контаминацију РНасе, одржавајте експериментално подручје чистим и носите чисте рукавице и маске током рада.
