М-МЛВ реверзна транскриптаза
РевСцрипт Реверзна транскриптаза се добија технологијом генетског инжењеринга.Има већу способност синтезе цДНК, термичку стабилност и ограничење температуре реакције (до 60°Ц).Синтетизовани цДНК производ је до 10 кб.Побољшава афинитет шаблона и погодан је за реверзну транскрипцију РНК шаблона са сложеном секундарном структуром или генима са ниским нивоом копије.
Компоненте
| Саставни део | HC2003Б (10.000У) | HC2003Б (5*10.000У) | HC2003Б (200.000У) |
| РевСцрипт реверзна транскриптаза (200У/μЛ) | 50 μЛ | 5×50 μЛ | 1 мЛ |
| 5 × РевСцрипт бафер | 250 μЛ | 1,25 мЛ | 5 мЛ |
Кондиција складишта
Овај производ треба чувати на -25°Ц~-15°Ц 2 године.
Дефиниција јединице
Једна јединица укључује 1 нмол дТТП-а у материјал нерастворљив у киселини за 10 минута на 37°Ц користећи Олиго(дТ) као прајмер.
Реацтион Сетуп
1.Денатурација РНК шаблона (Овај корак је опциони, денатурација РНК шаблона помаже да се отворе секундарне структуре, што ће побољшати принос првог ланца цДНК.)
| Компоненте | Волумен (μЛ) |
| ддХ без РНазе2O | До 13 |
| олиго(дТ)18 (50 μмол/Л) или случајни прајмер (50 μмол/Л) Или генски специфични прајмери (2 μмол/Л) | 1 |
| или 1 | |
| или 1 | |
| РНА шаблон | X a |
напомене:
1) а: Укупна РНК: 1-5 уг или мРНА: 1-500 нг
2) Инкубирати на 65°Ц 5 минута, а затим одмах пребацити на лед да се охлади 2 минута.Кратко центрифугирање да се сакупи реакциона течност, додајте реакциони раствор реверзне транскрипције као што је приказано у следећој табели.Нежно пипетирајте за мешање.
1.Припрема реакционе смеше (20 μЛ запремине)
| Компоненте | Волумен (μЛ) |
| Мешавина претходног корака | 13 |
| 5×Буффер | 4 |
| дНТП мешавина (10 нмол/Л) | 1 |
| Реверзна транскриптаза (200 У/μЛ) | 1 |
| Инхибитор РНазе (40 У/μЛ) | 1 |
1.Извршите реакцију под следећим условима:
| температура (°Ц) | време |
| 25 °Цa | 5минс |
| 42 °Цb | 15-30мин |
| 85 °Цc | 5минс |
напомене:
1) а.Инкубација на 25°Ц у трајању од 5 минута је потребна само за коришћење насумичних хексамера.Прескочите овај корак када користите Олиго (дТ)18или Гене Специфиц Пример.
2) б.Препоручена температура реверзне транскрипције је 42°Ц. За шаблоне са компликованим секундарним структурама или високим садржајем ГЦ, препоручује се подизање температуре реакције на 50-55°Ц.
3) ц.Загревање на 85°Ц током 5 минута да би се инактивирала реверзна транскриптаза.
4) Производ се може директно користити у ПЦР или кПЦР реакцијама, или чувати на -20°Ц за краткотрајно складиштење.Препоручљиво је ускладити производе и чувати на -80°Ц за дуготрајно складиштење.Избегавајте често замрзавање-одмрзавање.
5) Производ је погодан за РТ-кПЦР у једном кораку, препоручује се додавање 10-20 У реверзне транскриптазе за сваки реакциони систем од 25 μЛ или постепено повећање количине реверзне транскриптазе у складу са стварном ситуацијом.
Напомене
1.Одржавајте експериментално подручје чистим;Током рада треба носити чисте рукавице и маске.Сви потрошни материјали који се користе у експерименту треба да буду без РНазе да би се спречила контаминација РНазом.
2.Све процедуре треба изводити на леду како би се спречила деградација РНК.
3.Препоручују се висококвалитетни узорци РНК да би се осигурала висока ефикасност реверзне транскрипције.
4.Овај производ је само за истраживачку употребу.
5.Ради ваше безбедности радите са лабораторијским мантилима и рукавицама за једнократну употребу.
