Ензим за затварање вируса вакциније

Ензим за затварање вируса вакциније је изведен из рекомбинантног соја Е. цоли који носи гене за ензим за затварање вакциније.Овај појединачни ензим се састоји од две подјединице (Д1 и Д12) и има три ензимске активности (РНА трифосфатаза и гванилилтрансфераза од стране Д1 подјединице и гванин метилтрансферазе од стране Д12 подјединице).Ензим за затварање вируса вакциније је ефикасан да катализује формирање структуре капице, која може специфично везати 7-метилгванилатну капасту структуру (м7Гппп, Цап 0) на 5′ крај РНК.Структура капе (Цап 0) игра важну улогу у стабилизацији, транспорту и транслацији мРНК код еукариота.Покривање РНК ензимском реакцијом је ефикасан и једноставан метод који може значајно побољшати стабилност и транслацију РНК за ин витро транскрипцију, трансфекцију и микроињекцију.

Компоненте

Ензим за затварање вируса вакциније (10 У/μЛ)

10×Бафер за затварање

Услови складиштења

-25～- 15℃ за складиштење （ Избегавајте поновљене циклусе замрзавања-одмрзавања）

Бафер за складиштење

20 мМ Трис-ХЦл (пХ 8,0), 100 мМ НаЦл,

1мМ ДТТ, 0,1мМ ЕДТА, 0,1% Тритон Кс-100, 50% глицерол.

Дефиниција јединице

Једна јединица ензима за затварање вируса вакциније је дефинисана као количина ензима потребна да се 10 пмол ГТП-а угради у 80нт транскрипт за 1 сат на 37°Ц.

Контрола квалитета

егзонуклеаза:10У ензима за затварање вируса вакциније са 1 μг λ-Хинд ИИИ дигестира ДНК на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.

ендонуклеаза:10У ензима за затварање вируса вакциније са 1 μг λДНК на 37℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.

Ницкасе:10У ензима за затварање вируса вакциније са 1 μг пБР322 на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом агарозног гела.

РНасе:10У ензима за затварање вируса вакциније са 1,6 μг МС2 РНК током 4 сата на 37 ℃ не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом агарозног гела.

1.цоли ДНК:10У ензима за затварање вируса вакциније је тестиран на присуство геномске ДНК Е. цоли коришћењем ТакМан кПЦР са прајмерима специфичним за локус Е. цоли 16С рРНА.Контаминација геномске ДНК Е. цоли је ≤1 генома Е. цоли.

2.Бактеријски ендотоксин: ЛАЛ-тест, према Кинеској фармакопеји ИВ издање 2020, метода испитивања ограничења гела, опште правило (1143).Садржај бактеријског ендотоксина треба да буде ≤10 ЕУ/мг.

Реакциони систем и услови

1. Протокол затварања (реакциона запремина: 20 μЛ)

Овај поступак је применљив на реакцију затварања 10 μг РНК (≥100 нт) и може се повећати у складу са експерименталним захтевима.

И) Комбинујте 10 μг РНК и Х2О без нуклеазе у епрувети за микрофугирање од 1,5 мл до коначне запремине од 15,0 µЛ.*10×пуфер за затварање: 0,5 М Трис-ХЦл, 50 мМ КЦл, 10 мМ МгЦл2, 10 мМ ДТТ, (25 ℃, пХ 8,0)

2) Загревајте на 65℃ 5 минута, а затим ледено купатило 5 минута.

3) Додајте следеће компоненте наведеним редоследом

*10×Пуфер за затварање: 0,5 М Трис-ХЦл, 50 мМ КЦл, 10 мМ МгЦл2, 10 мМ ДТТ, (25 ℃, пХ 8,0)

4) Инкубирајте на 37°Ц 30 минута, РНК је сада затворена и спремна за низводне примене.

2. 5′ терминал реакција обележавања (реакциони волумен: 20 μЛ)

Овај протокол је дизајниран да означи РНК која садржи 5´ трифосфат и може се повећати у складу са захтевима.На ефикасност уградње етикете ће утицати моларни однос РНК:ГТП, као и садржај ГТП у узорцима РНК.

1) Комбинујте одговарајућу количину РНК и Х2О без нуклеазе у епрувети за микрофугирање од 1,5 мл до коначне запремине од 14,0 µЛ.

2) Загревајте на 65℃ 5 минута, а затим ледено купатило 5 минута.

3) Додајте следеће компоненте наведеним редоследом.

** ГТП МИКС се односи на ГТП и мали број маркера.За концентрацију ГТП, погледајтена напомену 3.

4) Инкубирајте на 37°Ц 30 минута, крај РНК 5′ је сада означен и спреман за низводно

Апликације

1. Затварање мРНА пре тестова транслације/ин витро транслације

2. Обележавање 5´ краја мРНА

Напомене о употреби

1.Загревање раствора РНК пре инкубације са Вацциниа Цаппинг Ензимом уклања секундарну структуру на 5′-крају транскрипта.Продужите време на 60 минута за транскрипте са познатим високо структурираним 5´крајовима.

2. РНК која се користи за реакције затварања треба пречистити пре употребе и суспендовати у води без нуклеаза.ЕДТА не би требало да буде присутна и раствор не би требало да садржи соли.

3. За обележавање 5´ краја, укупна концентрација ГТП треба да буде око 1-3 пута већа од моларне концентрације мРНК у реакцији.

4. Запремина реакционог система може се повећати или смањити у складу са стварним.