ПНГасе Ф
Пептид-Н-гликозидаза Ф (ПНГасе Ф) је најефикаснији ензимски метод за уклањање скоро свих Н-везаних олигосахарида из гликопротеина.ПНГаза Ф је амидаза, која цепа између већине унутрашњих ГлцНАц и аспарагинских остатака високо манозних, хибридних и комплексних олигосахарида из Н-везаних гликопротеина.
Апликација
Овај ензим је користан за уклањање остатака угљених хидрата из протеина.
Припрема и спецификација
| Изглед | Безбојна течност |
| Чистоћа протеина | ≥95% (са СДС-ПАГЕ) |
| Активност | ≥500.000 У/мЛ |
| Егзогликозидаза | Није могуће открити никакву активност (НД) |
| Ендогликозидаза Ф1 | ND |
| Ендогликозидаза Ф2 | ND |
| Ендогликозидаза Ф3 | ND |
| Ендогликозидаза Х | ND |
| Протеасе | ND |
Својства
| ЕЦ број | 3.5.1.52(Рекомбинантно из микроорганизама) |
| Молекуларна тежина | 35 кДа (СДС-ПАГЕ) |
| Изоелектрична тачка | 8. 14 |
| Оптимални пХ | 7.0-8.0 |
| Оптимална температура | 65 °Ц |
| Специфичност супстрата | Цепање гликозидних веза између ГлцНАц и остатака аспарагина Слика 1 |
| Сајтови за препознавање | Н-везани гликани осим ако не садрже α1-3 фукозу Слика 2 |
| Активатори | ДТТ |
| Инхибитор | СДС |
| Температура складиштења | -25 ~-15 ℃ |
| Инактивација топлоте | Реакциона смеша од 20 µЛ која садржи 1 µЛ ПНГасе Ф се инактивира инкубацијом на 75 °Ц током 10 минута. |
Слика 1 Специфичност супстрата ПНГасе Ф
Слика 2 Препознавање места ПНГасе Ф.
Када су унутрашњи ГлцНАц остаци повезани са α1-3 фукозом, ПНГасе Ф не може да цепи Н-везане олигосахариде из гликопротеина.Ова модификација је уобичајена код биљака и неких гликопротеина инсеката.
Cопоненти
|
| Компоненте | Концентрација |
| 1 | ПНГасе Ф | 50 µл |
| 2 | 10×Пуфер за денатурацију гликопротеина | 1000 µл |
| 3 | 10×ГлицоБуффер 2 | 1000 µл |
| 4 | 10% НП-40 | 1000 µл |
Дефиниција јединице
Једна јединица (У) је дефинисана као количина ензима потребна за уклањање >95% угљених хидрата из 10 µг денатурисане РНКазе Б за 1 сат на 37°Ц у укупној реакционој запремини од 10 µЛ.
Услови реакције
1.Растворите 1-20 µг гликопротеина са дејонизованом водом, додајте 1 µл 10×Гликопротеинског денатурирајућег пуфера и Х2О (ако је потребно) да бисте добили укупну запремину реакције од 10 µл.
2.Инкубирајте на 100°Ц 10 мин, охладите на леду.
3.Додати 2 µл 10×ГлицоБуффер 2, 2 µл 10% НП-40 и промешати.
4.Додајте 1-2 µл ПНГасе Ф и Х2О (ако је потребно) да се добије укупна запремина реакције од 20 µл и промешати.
5.Инкубирати реакцију на 37°Ц током 60 мин.
6.За СДС-ПАГЕ анализу или ХПЛЦ анализу.
