мРНА Цап2'-О-метилтрансфераза

мРНА Цап 2´ -О-метилтрансфераза је изведена из рекомбинантног соја Е. цоли који носи ген за мРНА Цап 2 ´-О-метилтрансферазе вакциније.Овај ензим додаје метил групу на 2´-О позицији првог нуклеотида поред структуре капице на 5′-крају РНК. Ензим користи С-аденозилметионин (САМ) као донатора метила за РНК затворену метилацијом (цап -0) што резултира структуром цап-1.

Структура Цап1 може повећати ефикасност транслације, побољшавајући експресију мРНК у експериментима трансфекције и микроињекције. Овај ензим посебно захтева РНК са м7ГпппН капом као супстратом.Не може да користи РНК са пН, ппН, пппН или ГпппН на крају 5´.Капирана РНК се може припремити ин витро транскрипцијом коришћењем цап аналога или ензимским затварањем помоћу ензима за затварање вакцине.

Компоненте

мРНА Цап 2´-О-метилтрансфераза (50У/μЛ)

10×Реакциони пуфер за затварање

Складиште

-25 ～- 15 ℃ за складиштење （ Избегавајте поновљене циклусе замрзавања-одмрзавања）

Бафер за складиштење

20 мМ Трис-ХЦл (пХ 8,0，25℃), 100 мМ НаЦл, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЕДТА, 0,1% Тритон Кс-100, 50% глицерол.

Дефиниција јединице

Једна јединица је дефинисана као количина ензима потребна за метиловање 10 пмола 80 нт затвореног РНК транскрипта за 1 сат на 37°Ц.

Тестови контроле квалитета

Егзонуклеаза:50У мРНА Цап 2´-О-метилтрансферазе са 1μг λ-Хинд ИИИ дигестира ДНК на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.

Ендонуклеаза: 50 У мРНА Цап 2 ´ -О-метилтрансферазе са 1 μг λДНК на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом агарозног гела.

Ницкасе: 50У мРНА Цап 2´ -О-метилтрансферазе са 1 μг пБР322 на 37 ℃ током 16 сати не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом у агарозном гелу.

РНасе: 50У мРНА Цап 2 ´ -О-метилтрансферазе са 1,6 μг МС2 РНК током 4 сата на 37 ℃ не даје деградацију као што је утврђено електрофорезом агарозног гела.

E. цоли ДНК: 50У мРНА Цап 2´-О-метилтрансферазе се тестира на присуствоE. цоли геномска ДНК коришћењем ТакМан кПЦР са прајмерима специфичним заE. цоли 16С рРНА локус.ТхеE. цоли контаминација геномском ДНК је =1E. цоли геном.

Бактеријски Ендотоксин: ЛАЛ-тест, према Кинеској фармакопеји ИВ 2020 издање, метода испитивања ограничења гела, опште правило (1143).Садржај бактеријског ендотоксина треба да буде =10 ЕУ/мг.

Реакциони систем и услови

1. Комбинујте одговарајућу количину затворене РНК и Х2О без РНазе у епрувети за микрофугирање од 1,5 мЛ до коначне запремине од 16,0 µЛ.

2. Загревајте на 65℃ 5 минута, а затим у леденом купатилу 5 минута.

3. Додајте следеће компоненте наведеним редоследом (за метилацију затворене РНК

мање од 10

*10× Реакциони пуфер за затварање: 500 мМ Трис-ХЦл (пХ 8,0, 25 ℃), 50 мМ КЦл, 10 мМ МгЦл2 、 10 мМ ДТТ.

4. Инкубирајте на 37℃ 1 сат (2 сата инкубације се препоручује за циљни фрагмент мањи од 200 нт).

Апликације

За побољшање експресије мРНА током експеримената микроињекције и трансфекције.

Напомене о употреби

1. Пре реакције, РНК треба да се пречисти и раствори у води без нуклеаза, сви раствори не смеју да садрже ЕДТА и јоне.

2. Препоручује се загревање узорка РНК на 65℃ 5 минута пре реакције да би се уклонила секундарна структура на 5´крају транскрипта.Може се продужити на 10 мин за сложену 5 ´-терминалну структуру.