Дволанчана РНК (дсРНА) ЕЛИСА КИТ

Овај комплет је ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА) који се спаја са системом биотин-стрептавидин, за квантитативно мерење дсРНК дужине изнад 60 парова база (бп), без обзира на секвенцу.Плоча је претходно обложена анти-дсРНА антителом.дсРНА присутна у узорку је додата и везује се за антитела обложена на бунарчићима.Затим се додаје биотиниловано анти-дсРНА антитело и везује се за дсРНА у узорку.После испирања, додат је ХРП-стрептавидин и везује се за биотиниловано анти-дсРНА антитело.Након инкубације невезани ХРП-стрептавидин се испере.Затим се додаје раствор ТМБ супстрата и катализира га ХРП да би се добио производ плаве боје који се променио у жуту након додавања киселог стоп раствора.Густина жуте боје је пропорционална циљној количини дсРНА ухваћене у плочи.Апсорбанција се мери на 450 нм.

Апликација

Овај комплет је за квантитативно мерење резидуалне дсРНА.

Компоненте комплета

Складиштење и стабилност

1. За неискоришћени комплет: Цео комплет се може чувати на 2~8℃ током рока трајања.Јаку светлост треба избегавати ради стабилности складиштења.

2. За коришћени комплет: Када се микроплоча отвори, покријте неискоришћене јажице заптивачем за плоче и вратите се у кесицу од фолије која садржи паковање средства за сушење, запечатите кесицу од фолије и вратите се на 2~8℃ што је пре могуће након употребе.Остале реагенсе треба вратити на 2~8℃ што је пре могуће након употребе.

Потребни материјали, али нису испоручени

1. Читач микроплоча са филтером од 450±10 нм (боље ако може да детектује на таласној дужини од 450 и 650 нм).

2. Шејкер за микроплоче.

3. Врхови и епрувете за центрифугирање без РНазе.

Дијаграм тока операције

Пре него што почнете

1. Све компоненте комплета и узорке доведите на собну температуру (18-25℃) пре употребе.Ако се комплет неће потрошити у једном тренутку, извадите само траке и реагенсе за садашњи експеримент, а преостале траке и реагенсе оставите у потребном стању.

2. Пуфер за прање: разблажите 40 мЛ 20× концентрованог пуфера за испирање са 760 мЛ дејонизоване или дестиловане воде да бисте припремили 800 мЛ 1× пуфера за прање.

3. Стандард: кратко центрифугирајте или центрифугирајте основни раствор пре употребе.Концентрација четири понуђена стандарда је 5нг/μЛ.За стандарде УТП и пУТП дсРНА, разблажите основни раствор на 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0пг/μЛ са СТЕ пуфером да бисте нацртали стандардну криву.За стандарде Н1-Ме-пУТП дсРНА, разблажите основни раствор на 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0пг/μЛ са СТЕ пуфером да бисте нацртали стандардну криву.За стандард 5-ОМе-УТП дсРНА, разблажите основни раствор на 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0пг/μЛ са СТЕ пуфером да бисте нацртали стандардну криву.Препоручујемо да се стандарди могу разблажити као следеће графиконе:

4. Биотиниловано детекционо антитело и радни раствор ХРП-стрептавидина: кратко центрифугирајте или центрифугирајте основни раствор пре употребе.Разблажите их до радне концентрације пуфером за разблаживање.

5. ТМБ подстање: аспирирајте потребну дозу раствора стерилизованим врховима и немојте поново бацати преостали раствор у бочицу.ТМБ супстрат је осетљив на светлост, не излажите ТМБ подлогу светлу дуго времена.

Коришћење протокола

1. Одредите број трака потребних за тест.Уметните траке у оквире за употребу.Преостале траке плоча које се не користе у овом тесту треба поново упаковати у врећу са средством за сушење.Чврсто затворите кесу за складиштење у фрижидеру.

2. Додати по 100 μЛ разблажења стандарда, слепог узорка и узорака у одговарајућа лежишта.Покријте заптивачем плоче.Инкубирајте 1 сат на собној температури уз мућкање на 500 обртаја у минути.Узорке треба разблажити СТЕ пуфером до одговарајуће концентрације за тачан тест.

3. Корак испирања: Аспирирајте раствор и исперите са 250 μЛ пуфера за испирање у сваки бунар и оставите да одстоји 30 секунди.У потпуности одбаците пуфер за прање тако што ћете плочу закачити на упијајући папир.Потпуно опрати 4 пута.

4. Додајте 100 μЛ радног раствора биотинилованог детекционог антитела у сваки бунар.Покријте заптивачем плоче.Инкубирајте 1 сат на собној температури уз мућкање на 500 обртаја у минути.

5. Поновите корак прања.

6. Додајте 100 μЛ радног раствора ХРП-стрептавидина у сваки бунар.Покријте заптивачем плоче.Инкубирајте 30 минута на собној температури уз мућкање на 500 обртаја у минути.

7. Поновите корак прања поново.

8. Додајте 100 μЛ раствора ТМБ супстрата у сваки бунар.Покријте заптивачем плоче.Инкубирајте 30 мин на собној температури Заштитите од светлости.Течност ће постати плава додавањем раствора супстрата.

9. Додајте 50 μЛ стоп раствора у сваки бунар.Течност ће постати жута додавањем стоп раствора.Затим покрените читач микроплоча и одмах извршите мерење на 450 нм.

Израчунавање резултата

1. Просечите дуплирана очитавања за сваки стандард, контролу и узорке и одузмите просечну нулту стандардну оптичку густину.Конструишите стандардну криву са апсорпцијом на вертикалној (И) оси и концентрацијом дсРНА на хоризонталној (Кс）оси.

2. Препоручује се да се прорачун изврши помоћу компјутерског софтвера за прилагођавање криве, као што је цурве екперт 1.3 или ЕЛИСА Цалц у моделу нелинеарног уклапања са 5 или 4 параметра.

Перформансе

1. Осетљивост:

доња граница детекције: ≤ 0,001 пг/μЛ (за УТП-, пУТП-, Н1-Ме-пУТП-дсРНА), ≤ 0,01 пг/μЛ (за 5-ОМе-УТП-дсРНА).

доња граница квантификације: 0,0156 пг/μЛ (за УТП-, пУТП-дсРНА), 0,0312 пг/μЛ (за Н1-Ме-пУТП-дсРНА), 0,0625 пг/μЛ (за 5-ОМе-УТП-дсРНА).

2. Прецизност: ЦВ интра-теста ≤10%, ЦВ интер-есеја ≤10%

3. Опоравак: 80% ~ 120%

4.Линеарност:0,0156-0,5пг/μЛ(заУТП-,пУТП-дсРНА)0,0312-1пг/μЛ(заН1-Ме-пУТП дсРНА),0,0625-1пг/μЛ(за 5-ОМе-УТП-дсРНА).

Разматрања

1. Температура и време реакције ТМБ су критични, молимо вас да их строго контролишете у складу са упутствима.

2. Да би се постигла добра поновљивост и осетљивост теста, неопходно је правилно прање плоча да би се уклонио вишак нереагованих реагенса.

3. Све реагенсе треба темељно измешати пре употребе и избегавати буббле током додавања узорка или реагенса.

4. Ако су се кристали формирали у концентрованом пуферу за прање (20к), загрејте на 37℃ и лагано мешајте док се кристали потпуно не растворе.

5. Избегавајте анализу узорака који садрже натријум азид (НаН3), јер би то могло да уништи активност ХРП-а што резултира потцењивањем количине дсРНА.

6. Избегавајте контаминацију РНасе током анализе.

7. Стандард/узорак, детекционо антитело и СА-ХРП се такође могу спровести на собној температури без мућкања, али то може довести до смањења осетљивости детекције за једноструко.У овом случају препоручујемо да се стандарди УТП и пУТП дсРНА разблаже са 2пг/μЛ, Н1-Ме-пУТП дсРНА стандарди треба да се разблаже са 4пг/μЛ, а стандард 5-ОМе-УТП дсРНА треба да се разблажи са 8пг/μЛ.Поред тога, инкубирајте радни раствор ХРП-стрептавидина 60 минута на собној температури.Немојте користити шејкер за флашице, јер он може да доведе до нетачног резултата.

Типичан резултат

1. Подаци стандардне криве

2. Прорачун стандардне криве

3. Опсег детекције облоге: 0,0312- 1 пг/μЛ